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免核酸提取荧光定量PCR方法应用
分子检测方法由于具有的高敏感性、高通量和适合的,越来越频繁的应用在兽医诊断中.在检测过程中,常需要对检测样本进行核酸提取纯化,需要投入大量的时间,其复杂的提取步骤容易造成交叉污染.为能更加快速准确的进行疫病检测,免核酸提取产品成为了疫病检测的最佳选项.本文通过对禽流感病毒培养物、临床样本中的病毒核酸进行研究,用以评价免核酸提取与常规核酸提取两者在阳性符合率、病毒复制、检测效果等方面的差异,为临床疫病检测监控提供参考.
1 材料和方法
1.1 样本
样本采集方法：用无菌棉拭子探入喉头口及上颚裂来回刮3～5次取咽喉分泌液,放入加有无菌1 毫升PBS缓冲液的无菌1.5 毫升离心管中备用.样本来源：全省抽取的5000例家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子、禽流感H5、H7、H9病毒培养样本各选取1例.
1.2 试剂与方法
1.2.1 常规荧光定量P C R检测法 使用天根生化科技（北京） 有限公司的磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒,配套赛默飞KingFisher Flex全自动核酸提取仪对病毒培养物样本、稀释的病毒培养物样本、临床样本进行核酸提取制备,提取时间为40～60分钟.核酸提取完毕后,用Q I A G E N的禽流感 H5/H7/H9荧光定量P C R试剂盒,对病毒培养物核酸、稀释的病毒培养物核酸、临床样本核酸进行荧光定量聚合酶链式反应（P C R法）检测；将上述处理好的核酸样本加样上机,用A B I7500荧光定量P C R仪进行扩增,收集荧光信号,进行结果判定.本阶段时间为90分钟.整个实验整体完成时间为130～150分钟.
1 . 2 . 2 免提取荧光定量P C R检测法 使用北京大有泰莱生物技术有限公司的禽流感H5/H7/H9免提取荧光定量PCR试剂盒,对病毒培养物核酸、稀释的病毒培养物核酸、确诊的临床阳性样本核酸进行荧光定量P C R方法进行检测；用试剂盒配套的样本处理液将样本进行待检处理,直接加样上机,用赛默飞A B I7500荧光定量P CR仪进行扩增,收集荧光信号,进行结果判定.本阶段时间为100分钟.整个实验整体完成时间为105～110分钟.
2 实验结果
2.1 常规荧光定量P C R和免提取荧光定量P C R对病毒培养物检测结果对比
对于H5、H7和H9病毒培养物样本,根据100、10-1、1 0 - 2 、1 0 - 3 和1 0 - 4 的稀释倍数,分别进行病毒核酸检测,免提取荧光定量PCR检测结果和传统荧光定量PCR检测结果一致,符合率100%.检测数据结果见表1.
结果表明高病毒浓度的病毒培养物、低病毒浓度的病毒培养物,免核酸提取方法均能满足准确检测判定的需求.
2.2 常规荧光定量P C R和免提取荧光定量P C R对临床样本的检测结果
对5 0 0 0 份临床样本, 用Q I A G E N的常规荧光荧光定量P C R试剂盒检测,样本阴阳性判定结果见表2.
确诊为阳性样本的,再根据100、10-1、10-2和10-3的稀释倍数,分别进行H5、H9病毒检测,其阳性符合率依然一致.检测数据见表3.
结果表明高病毒浓度的临床样本、低病毒浓度的临床样本,免提取的荧光定量P C R试剂均能满足准确检测判定的需求.
应用免核酸提取方法对禽流感病毒H5/H7/H9亚型的病毒培养物、稀释的病毒培养物、临床阳性样本、稀释的临床弱阳性样本进行检测.检测结果与常规核酸提取荧光定量P C R检测方法结果一致,可以满足禽流感病毒H5/H7/H9亚型的病毒检测需求.综上所述,免核酸提取荧光定量P C R方法检测的阳性复合率100%符合,且可以有效的提高实验效率,此方法可以有效应用于动物疫病临床监测.
作者简介:魏园园( 19 8 3 -) ,女, 中级兽医师.
应用研究论文范文结:
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