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小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的液相色谱检测和胶体金试纸法分析比较

摘　要：本文以小麦作为分析对象,建立免疫亲和高效液相色谱分析小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的检测方法,研究DON 在分析对象中的分布变化规律.该方法采用免疫亲和柱净化,以甲醇∶乙腈∶水等于10 ∶ 10 ∶ 80（V/V/V）为流动相,进样量100 μL,该方法检出限为25 μg/kg.胶体金试纸法检出范围0 ～ 4 000 μg/kg,对这些样本用液相色谱法和胶体金检测试纸法进行测定,精确度为85.4% ～ 128.2%,平均101.2%.

关键词：高效液相色谱；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；小麦；快速检测方法

Abstract：In this paper, wheat was used as the analysis object to establish a method for thedetermination of deoxynivalenol (DON) in wheat by immunoaffinity high performance liquid chromatography(HPLC). The distribution of DON in the analyzed objects was studied. The method was purified byimmunoaffinity column and the mobile phase was methanol ∶ acetonitrile ∶ water等于10 ∶ 10 ∶ 80 (V/V/V),and the injection volume was 100 μL. The detection limit was 25 μg/kg. Rapid quantitative detectionmethod, deoxynivalenol enol colloidal gold test paper detection range 0 ～ 4000 μg/kg, these sampleswere determined by liquid chromatography and colloidal gold test paper method, the accuracy range was85.4 % ～ 128.2%, an erage of 101.2%.

Key words：High performance liquid chromatography; Deoxynivalenol; Wheat; Rapid detection method

中图分类号：R155.5

脱氧雪腐镰刀菌俗称呕吐霉素（DON）,是一种在小麦、玉米中常见的毒素,这种毒素对人体健康有较大的威胁,摄入这种毒素过多会导致胃癌的发生.粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法主要是国家标准中的液相色谱法以及快检中的酶联免疫法和胶体金检测法.液相色谱法主要是仪器检测,灵敏、准确度高,但耗时长,酶联免疫法和胶体金检测法属于定性和半定量的快速检测方法,耗时较短,有利于批量筛选工作[1].本文是通过高效液相色谱和胶体金试纸方法分别对小麦样品中的DON 进行检测,比较两种方法的差别,从而为实验室人员提供参考,建立一种能够快速发现、快速确认的实验室方法.

1　材料与方法

1.1　液相色谱法

1.1.1　仪器与试剂

Waters e2695 液相色谱仪（配紫外检测器,Waters公司）、高速均质器（飞利浦公司）、玻璃纤维滤纸（英国Whatman 公司）、6 位空气泵操作架（北京中检维康公司）、电子天平（梅特勒公司）、氮吹仪（无锡沃信公司）、免疫亲和柱（美国Vicam 公司）.色谱纯甲醇（中国国药）、色谱纯乙腈（中国国药）、聚乙二醇PEG8000（美国Vicam 公司）、超纯水（美国Millipore 公司）.

呕吐毒素标准储备溶液（纯度大于99.5%）：200 μg/mL.

呕吐毒素标准工作溶液：分别取0.1mL 呕吐毒素标准溶液,氮气仪吹干后,用流动相（甲醇+ 乙腈+ 水等于10+10+80）分别配制浓度为100、300、500、1 000、2 000、4 000 μg/L 以及6 000 μg/L 的DON 标准工作溶液.

1.1.2　样品净化

玻璃注射器下连接免疫亲和柱,准确移取2 mL 混匀的滤液于玻璃注射器中,连接空气泵和玻璃注射器,调节空气压力,使溶液以每秒1 ～ 2 滴的速度通过免疫亲和柱,直至空气完全进入到免疫亲和柱中.用5 mL 高纯水淋洗免疫亲和柱,流速保持在每秒1 ～ 2滴,直至空气完全通过免疫亲和柱.准确加入1.0 mL色谱纯甲醇到玻璃注射器中,淋洗免疫亲和柱并收集1.0 mL 全部样品洗脱液于玻璃测试管中.

1.1.3　提取液定容

将1.0mL 洗脱液用氮气仪吹干后,用300 μL 流动相（甲醇+ 乙腈+ 水等于10+10+80）定容洗脱液,进高效液相色谱仪分析测定.

1.1.4　仪器条件

色谱柱：Agilent C18,5 μm,4.6 mm×250 mm；流动相：甲醇∶乙腈∶水（V/V,10 ∶ 10 ∶ 80）；流速：0.8 mL/min；进样量：100 μL；柱温：30 ℃；检测器：紫外检测器；检测波长：218 nm.

1.2　胶体金试纸检测方法

1.2.1　仪器与试剂

HF6000 便携式试纸读数仪（北京华安麦科公司）、干式加热器（北京华安麦科公司）、移液（20 ～ 200 μL,100 ～ 1 000 μL,1 ～ 10 mL）、样品提取液（纯水）、呕吐毒素快速测定试纸条（北京华安麦科公司）.

1.2.2　样品处理

称量5.0 g 样本,粉碎、加入离心管中,量取20 mL纯水加入,加上塞子,振荡1 min,静置分层或4 000 r/min离心3 min 得上清液,取2 000 μL 样品稀释液,加入上清液50 μL,充分振荡混匀后,待检.若测试结果超出曲线范围上限,需要再次检测时,可取上述所得提取上清液,用样品提取液（纯水）对倍稀释,再进行同样的以下操作.

1.2.3　样品测试

①将快速测定试纸条、微孔试剂、待测样品在室温环境下放置20 min 冷却至室温.②将微孔试剂放入加热器中,调节温度至40 ℃,5 min 后取出试剂条待用.③移取待检液200 μL 于微孔中,充分混匀.④立刻将试纸条充分浸入微孔试剂中,计时5 min,取出试纸条在1 min 内检测结果[2].

2　检测结果准确度比较分析

本实验对20 份小麦样本分别采用液相色谱法和胶体金检测试纸法测定,将采用两种试验方法得到的测定值进行比较（液相色谱法测定结果作为参考）,运用公式：

通过计算精确度的范围在85.4% ～ 128.2%,平均101.2%.结果详见表1.

3　结论

本文以小麦作为分析对象,采用免疫亲和高效液相色谱分析小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）,研究DON 在分析对象中的分布变化规律.该方法采用免疫亲和柱净化,以甲醇∶乙腈∶水等于10 ∶ 10 ∶ 80（V/V/V）为流动相,进样量100 μL,方法检出限为25 μg/kg.

胶体金试纸方法检出范围0 ～ 4 000 μg/kg,对这些样本用液相色谱法和胶体金检测试纸法进行测定,得到精确度的范围在85.4% ～ 128.2%,平均101.2%.在实验室的样品检验中可以通过胶体金检测试纸法进行筛选,对于超标的可以再进行高效液相色谱法进行验证,有利于提高实验室的检验效率.

参考文献：

[1] 王　莹,董颖超,陆成慧,等. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金检测试纸的研制与应用[J]. 粮食与食品工业,2014,21（5）：85-91.

[2] 刘　坚,毛红霞. 小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测及分布研究[J]. 粮食科技与经济,2018,43（6）：83-86.

作者简介：栾振祥（1981—）,男,工程师；专业方向为检验和标准化.