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重组鱼类干扰素进展
孔德荣1,王智诚1,刘海映2,王秀利1
（1．大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023；2大连海洋大学海洋科技与环境学院,辽宁大连,116023）
摘 要：干扰素(Interferons,IFNs)是由免疫细胞分泌的能对几种病原,例如对病毒、细菌、寄生虫和肿瘤细胞等产生应答的一类蛋白质.本文综述了几种经济鱼类的干扰素基因及重组鱼类干扰素的研究进展.
关键词：经济鱼类；干扰素基因；重组干扰素
干扰素(Interferon,IFN)是一类能够诱导细胞产生抗病毒状态的细胞因子,它不直接参与抗病毒的生物学过程,而是通过产生靶基因下游的效应基因来调控病毒的感染,具有多效能、低分子量、分泌型等特点口].干扰素最初是由Issacs等人在鸡胚绒毛尿囊膜细胞的病毒干扰实验中被发现.不同物种间干扰素的基因结构和亚基组成具有较大的差异,根据干扰素与受体结合的方式和其与抗体结合的抗原性不同可分为三类：工型干扰素主要包括a和β2,Ⅱ型干扰素只有一个成员为y型干扰素和Ⅲ型干扰素λ.干扰素作为机体最重要的细胞因子之一,主要生物学功能体现为广谱的抗病毒活性和免疫调节能力..根据人和哺乳动物的相关研究,干扰素对病毒防御的主要方式是通过转导信号和激活相关转录,导致下游基因受干扰素的表达调控,生成多种调控因子直接作用于入侵的病毒,保护机体免受感染.
斑马鱼（Danio rerio）、大西洋鲑鱼（Salrn,osalar）和斑点绿河纯（Tetraodon nigroviridis）等鱼类的干扰素基因于2003年被克隆到,之后,许多其他的硬骨鱼的干扰素基因被克隆和鉴定.鱼类的干扰素可以分为两类：工型、Ⅱ型(IFNy).工型是最早被发现的IFN家族成员,能够调节多种免疫细胞的发育和分化、诱导表达以及细胞凋亡和抑制肿瘤基因诱导的转化.与鸟类和哺乳动物的工型干扰素基因结构不同的是,鱼类工型基因包含5个外显子和4个内含子,而鸟类和哺乳动物的工型干扰素基因不含内含子.在哺乳动物中,Ⅱ型干扰素也叫做IFN- y,是由一个独立基因编码的,该基因含有4个外显子和3个内含子.Ⅱ型干扰素是一种典型的Thl细胞因子,主要由CD4+- Thl细胞和NK细胞产生,能够激活Thl的反应和活化巨噬细胞.鱼类的Ⅱ型干扰素与哺乳动物的Ⅱ型干扰素同源,许多鱼类拥有两种Ⅱ型干扰素(IFN yl和IFNy2).
鱼类是水产养殖中重要的经济物种,随着其规模化、工厂化的高密度养殖,其病害时有爆发,这严重制约了鱼类养殖业的可持续健康发展,给养殖生产者造成了巨大的经济损失.在鱼类养殖过程中,除加强综合管理外,还要针对不同鱼的品种的特定疾病采取预防和治疗措施,但效果甚微.为达到预防病原菌和病毒的目的,提高鱼类自身免疫能力对于增强其抗病力至关重要.因干扰素的生物学作用,科研工作者已将部分鱼类的干扰素基因通过基因工程技术制备重组鱼类干扰素,为今后取代抗生素或化学药物在鱼类病害防治上的应用提供了参考.下面,简要介绍几种经济鱼类的干扰素及其干扰素基因的重组表达情况.
1草鱼的干扰素及其基因的重组表达与应用
草鱼是我国重要的淡水经济鱼类,主要以混养为主,但养殖过程中出现的“四病”及病原微生物对草鱼产量及质量造成一定的损失.很多学者致力于提高草鱼免疫力的研究.起初,研究者将人a- 干扰素(hu IFN -a)基因序列转入到草鱼基因组内,成功获得表达人a-干扰素蛋白的转基因草鱼,通过一段时间的养殖发现,转基因草鱼的抗病能力较普通草鱼的抗病能力高；后续实验证明转植基因能够遗传给后代,且雌核发育阳性率高,但在遗传过程中受外界或者遗传因素的影响会有部分丢失.
草鱼的干扰素及相关基因研究较为广泛,主要分为以下几类：
I型干扰素：MTT法(MTT assay)测定原核表达并经纯化后的重组草鱼工型干扰素(rCiIFN)对草鱼肾细胞系CIK细胞的抗草鱼出血病毒(Gras Carp Hemorrhage Virus,GCHV),结果显示rCiIFN的生物活性与其浓度呈正相关关系[14].后续通过注射实验检测到重组rCiIFN蛋白能够上调干扰素相关基因IFN、IRF -1、IRF7、STAT- 3、MX、PKR的表达,且效果较聚肌胞苷酸( polyinosinic polycytidylic acid, polyl: C)的诱导效果好；目前,草鱼rCiIFN已被大量发酵,并找到最佳给药方式,且将草鱼rCiIFN蛋白掺入饲料中可有效提高草鱼幼鱼成活率.工型干扰素是多基因家族,主要包括IFNa、β等10余种亚型,最主要且研究最多的应属IFNa、β两种基因.草鱼IFNa已被成功扩增出目的序列并获得高纯度rCiIFNa蛋白,抗病毒实验证明其具有生物学活性,且对于鱼类细胞系抗病毒效果良好.
干扰素y：草鱼干扰素y也称为干扰素- rel(IFN- rel),利用同源克隆并结合RACE的方法成功获得草鱼IFNy2的cDNA全长序列.已构建pET30a(+) IFN rel重组表达载体,转化至大肠杆菌胞内成功获得高纯度的重组草鱼IFNy2蛋白.以重组IFN rel蛋白刺激草鱼头肾细胞,能有效促进脂多糖( Lipopolysaccharide,LPS)诱导IL-lj3 mRNA表达水平.同时,将构建的真核表达载体pcDNA3.1 myc his转染至HEK293细胞内,会使草鱼头肾细胞中IL8的基因表达上调[19].
2鲤鱼的干扰素基因
鲤鱼的干扰素基因的研究与草鱼相比较为缓慢,陈义龙等通过PCR获得了鲤鱼干扰素y-2j3的全长序列.序列分析表明,鲤鱼干扰素基因具有较高的保守性,剪接点之间严格遵守GT- AG规则,对于其表达与应用还需要进一步研究.鲤鱼干扰素调节因子的研究相对较成熟,通过RACE技术克隆得到IRF1、IRF5基因的cDNA序列,实验证明,鲤鱼的IRF1、IRF5虽具有不同的表达模式,但都可能在抗病毒过程中发挥作用.韦信贤[22]等人,构建过表达载体鲤鱼Toll样受体2(CcTLR2),同时转染到鲤鱼上皮瘤,结果发现TLR2可以使干扰素调节因子上调并抑制病毒的增殖.
3 黑青斑河纯和红鳍东方纯的重组干扰素
黑青斑河纯干扰素IFNyl、IFNy2两种基因均得到了克隆,现已证明黑青斑河纯IFNyl与IFNy2表达模式存在较大差异.构建高效表达载体,原核表达黑青斑河纯重组IFNyl蛋白,并以不同浓度重组蛋白刺激头肾细胞,结果表明纯化得到的重组蛋白具有生物学活性,且能够刺激细胞增殖.
马普等(2015)c24]提取红鳍东方纯肾脏组织的总RNA,进行RT PCR扩增得到干扰素y(IFNy)基因序列.将红鳍东方纯IFNy成熟肽序列与表达载体PET 32a(+)相连,构建了重组表达载体pET- 32a-IFNy；将其成功转化入E．coli BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,pET-32a IFNy在BL21中得到了融合表达.进行表达产物的纯化和Western Blotting检测,结果显示红鳍东方纯IFNy基因在大肠杆菌中的表达量较高,获得目的蛋白准确.该研究为后续红鳍东方纯重组干扰素y活性验证及应用奠定了基础.
4半滑舌鳎和大菱鲆的干扰素
半滑舌鳎干扰素的研究主要体现在其相关基因功能的研究与应用上.龙昊[25]从半滑舌鳎cDNA文库中克隆得到IFIT家族中的一个基因CsIFITl,生物学软件分析其结构,qRT- PCR实验分析CsIFITl在免疫相关的器官组织中的表达情况.研究发现在半滑舌鳎中通过过量表达CsIFITl可显著抑制肿大细胞病毒在鱼体中的复制,当降低CsIFITl表达后,病毒在组织中的复制量明显增高.也有研究表明半滑舌鳎ISG15在病毒感染实验中也发挥着类似的抗病毒作用,猜测其可能通过调节干扰素相关免疫因子间接发挥抗病毒作用[26].
林婧赟[27]采用同源克隆及RACE技术克隆得到大菱鲆干扰素刺激基因15 (ISG15).结构分析表明其包含两个类泛素结构域,C末端含有一个保守的RLRGG基序.表达分析ISG15在大菱鲆12个组织（包括脑、鳃、胃、肠等）呈组成型表达,且在头肾、体肾、脾等免疫相关组织中的表达量较高.大菱鲆受到poly I：C和TRBIV刺激后,ISG15基因在鳃、脾、头肾和肌肉中表达上调,这为ISG15在抗病毒免疫中发挥作用的途径提供了证据.
5 牙鲆的重组干扰素
牙鲆（Paralich,th,Vs olivaceus）同样有以上两种Ⅱ型干扰素的转录本,但这两个转录本极为相似,仅有三个核苷酸不同-28].目前,采用同源PCR和cDNA末端技术快速扩增褐牙鲆脾组织IRF5基因全长的cDNA(1869 bp)和DNA(3655bp,含9个外显子和8个内含子),其mRNA在鳃和头肾组织中表达水平较高,在脑、肝和皮肤中表达水平较低,揭示了该基因属于硬骨鱼IRF5亚群.同时利用干扰素诱导剂(Poly I：C)刺激IRF5基因导致了其晚而持久的上调,表明了该基因很有可能是一种干扰素刺激基因(ISG)c29].在牙鲆养殖中,爱德华氏病是一种常见的细菌性疾病,注射重组的Ⅱ型干扰素可以很大地提高其生存率.这表明重组的牙鲆Ⅱ型干扰素能够增强牙鲆免疫应答和抵抗爱德华氏菌的感染.
6 虹鳟和大西洋鲑的干扰素
Robertsen等确定并克隆大西洋鲑体内两种工型IFN( SasaIFN al、SasaIFN a2),SasaIFN - al基因cDNA序列感染人胚肾293细胞系产生了高生物学活性,使大西洋鲑细胞系免受IPNV病毒感染,同时诱导了Mx基因的表达.
Jun Zou等根据虹鳟与大西洋鲑基因组的高等同源性,从虹鳟头肾细胞的cDNA文库中筛选出虹鳟的IFN - y基因,并对其生物活性进行试验分析：两种基因混合免疫可增强虹鳟机体免疫力.闫春梅等将构建有荧光标记的两种重组真核表达质粒（鲤鱼IL - lβ及IFN基因序列）混合免疫待产虹鳟亲本并在受精过程中进行二次免疫,免疫荧光检测证明两种重组质粒表达良好,虹鳟幼鱼成活率较对照组高.刘敏对赤眼鳟Mx基因全长进行克隆、表达及重组载体构建,得到其在各组织的表达情况.含有IFN基因序列的真核载体pCR3.1转染至HEK293细胞内,经培养后细胞表达重组大西洋鲑干扰素能够抵抗传染性胰坏死病毒(IPNV)以保护大西洋鲑头肾TO细胞[.2].
7尼罗罗非鱼、斑点叉尾鲴和斜带石斑鱼的干扰素基因
吴芳等人克隆了尼罗罗非鱼y-干扰素基因,发现该基因的cDNA大小为690 bp,生物信息学分析推测编码206个氨基酸.qPCR检测发现正常尼罗罗非鱼个体y干扰素基因在不同组织中均有表达,且在脾脏中表达量最高,其次是肠、鳃和肾脏,在皮肤、心脏和肌肉组织中的表达量则较低,推测尼罗罗非鱼y干扰素参与鱼体对病原菌的防御过程,在免疫反应中发挥重要作用.
斑点叉尾鮰( channel catfish)能够产生两种Ⅱ型干扰素的mRNAs（IFN yl和IFN y2）,这两个mRNA在不同的组织和细胞类型中表达形式不同.研究表明,克隆出斑点叉尾鮰(的IFN -a基因,其开放阅读框由492个核苷酸组成,推测其编码产物由164个氨基酸组成.经核酸序列分析比对后发现,就干扰素y而言,斑点叉尾锢与鲶鱼的亲缘关系较近.此外,还有研究发现与其他鱼类重组克隆不同的是斑点叉尾鮰(的IFN似乎缺少第一个成熟的氨基酸和信号序列.8].
黄贝[39]等人已克隆出斜带石斑鱼的IFNycDNA序列,并通过感染polyl：C分析其IFNy组织表达情况,进而推测IFNy机体在抗病毒感染过程中发挥作用.对于干扰素的作用机理研究较少,但有人发现[40]干扰素下游基因Toll样受体通过依赖MyD88,或TRIF通路传导信号,从而诱导转录因子NF- KB和IRF的表达,启动机体非特异性免疫和获得性免疫而抵御病原入侵.
8结语
随着鱼类养殖规模的不断扩大、品种的不断增加,养殖过程中病害问题也日益严重.因此,养殖过程中开始出现抗生素滥用的情况,不仅会造成鱼类产生抗药性,还会使鱼类自身免疫系统受到损害,同时也会引起环境的二次污染.目前,在鱼类干扰素相关基因的克隆和调控等方面的研究已取得了重要的进展,为重组鱼类干扰素在鱼类病害防治上的开发和利用奠定了基础.
研究进展论文范文结:
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