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超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素工艺
超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素工艺
邓寒霜,曹华,李筱玲
（商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西商洛 726000）
摘 要押以葡萄籽为材料,采用硫酸-香草醛显色紫外可见分光光度法,测定原花青素的提取率并以此为评价指标,在单因素实验的基础上,选取乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素,通过正交试验对超声波辅助法提取葡萄籽原花青素工艺进行研究.结果表明,葡萄籽原花青素的最优提取工艺参数为乙醇浓度 80%、超声时间 20 min、料液比 1：25,提取 2 次,在此最优条件下其提取率为 4.45%.
关键词押超声波辅助法；葡萄籽；原花青素
中图分类号押TS461 文献标识码：Ａ 文章编号：1674-0033（2017）06-0056-04
Extraction of Proanthocyanidins from Grape Seeds
by Ultrasonic Assisted Method
DENG Han-shuang, CAO Hua, LI Xiao-ling
(Schcol of Biopharmaceutical and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, Shaanxi)
Abstract：With grape sceds as the material,using sulfuric acid vanillin colorimetric ultriolet visible spectrophotometry, determination of procyanidins absorbance at the welength of 500 nm, the extraction rate was calculated as the evaluation index, based on single factor experiment, select the ethanol concentration, extraction time and solid-liquid ratio were investigated, studied by orthogonal test, extraction the process of grape seed procyanidins ultrasonic assisted method. The results showed that the optimum extraction process of grape seed proanthocyanidins was ethanol concentration 80%, ultrasonic time 20 min, material liquid ratio 1：25 and extraction 2 times. Under this optimum condition, the extraction rate was 4.45%.
Key words：ESP； ultrasonic assisted method； grape seed； proanthocyanidins
葡萄,葡萄属（Vitis）藤本植物,约 60 种,原产于亚洲北部,目前广泛栽培于地中海地区. 在我国长江流域以北各地葡萄种植面积和产量都非常高,国内主产区在新疆,约占全国栽培面积的 30%[1].葡萄主要用于酿造葡萄酒、白兰地和甜露酒等,也可鲜吃或制成干果食用,如葡萄干、淡黄葡萄干和无核小葡萄干等.随着葡萄产量的增加以及对葡萄的使用,在葡萄制品的生产加工过程中产生了许多废弃物,如葡萄籽、葡萄皮、葡萄渣等. 其中葡萄籽主要为葡萄汁和葡萄酒加工等产业的废弃物, 约占整个葡萄重量的 5%～7%[2].我国葡萄资源丰富,据统计 2013 年全国葡萄总产量高达 1121.20 万吨[3],据此计算,每年葡萄籽的产量高达数十万吨. 相关研究表明葡萄籽里包含葡萄籽油、蛋白质、原花青素等物质,这些物质拥有较高的营养价值,还具有相当好的保健功能,在食品、药品、保健品等行业都可被安全使用[4]. 早期对于葡萄籽的研究多集中在葡萄籽油[5]和多糖[6]的范围内. 近年来,人们从葡萄籽和皮中分离出了具有较强抗氧化和清除自由基能力的功能因子———原花青素,其抗自由基的氧化能力是维生素 E 的 50 倍、维生素 C 的 20 倍[7]. 目前,大量的葡萄籽资源被当作废弃物处理, 或者直接做成简单的饲料卖给农户,易造成环境污染,降低天然资源的生物利用度,也不符合创新、协调、绿色、开放、共享的发展理念. 为了提高葡萄籽的生物利用度,本文对其中原花青素的提取工艺进行探讨.
1 材料与方法
1.1 实验材料
葡萄籽,采自市售葡萄,干燥至恒重后粉碎,过 45 目筛,装袋备用[8].
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的制作
精密称取原花青素标准品 20 mg,用无水乙醇溶解并定容至 50 mL,得标准品储备液. 精确吸取上述储备液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分别加入 2.0 mL 30 g·L-1 香草醛甲醇溶液及2.0 mL 30% H2SO4 甲醇溶液, 以无水乙醇定容至 10 mL,混均,在避光条件下于 30 ℃水浴反应20 min,以浓度为 0 的标准液为空白,在 500 nm处测定吸光度[9]. 以原花青素标准品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得标准曲线方程 y等于2.2592x+0.1022,R2等于0.9977. 线性范围为 0～0.24 mg·mL-1.
1.2.2 样品溶液处理
精密称取葡萄籽粉末 1 g, 置 150 mL 三角瓶中,按设定条件进行超声波辅助提取,离心,取上清液,残渣洗涤后沉淀,二次离心,合并两次上清液,定容至 50 mL,得到样品溶液.取稀释 5 倍后的样品溶液 1 mL,依照 1.2.1 的方法进行含量测定,计算原花青素提取率.
原青华素提取率（%）等于 n×CW×V ×100% (1)
式中：C———样品原花青素浓度（mg·mL-1）, V———提取液的体积 （mL）,n———稀释倍数 , W———葡萄籽粉末样品重量（mg）.
1.2.3 单因素试验
1）乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响精密称取葡萄籽粉末 1 g, 固定料液比为
1 ∶10, 提取时间 10 min, 分别在 40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇浓度下, 提取 2 次,依照 1.2.2 的方法进行含量测定,计算原花青素提取率.
2） 超声时间对葡萄籽原花青素提取率的影响
精密称取葡萄籽粉末 1 g,固定乙醇浓度为80%,料液比 1∶10,分别超声处理 10、20、30、40、 50、60 min,提取 2 次,依照 1.2.2 的方法进行含量测定,计算原花青素提取率.
3）料液比对葡萄籽原花青素提取率的影响精密称取葡萄籽粉末 1 g, 固定乙醇浓度为80%,超声时间 20 min,分别以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、 1∶30 的料液比,提取 2 次,依照 1.2.2 的方法进行含量测定,计算原花青素提取率.
4）提取次数对葡萄籽原花青素提取率的影响精密称取葡萄籽粉末 1 g, 固定乙醇浓度为
80%,超声时间 20 min,料液比 1∶20,分别提取 1次、 2 次、3 次,依照 1.2.2 的方法进行含量测定,计算原花青素提取率.
1.2.4 正交试验
因提取 2 次后样品中原花青素提取率增加不大,为提高工作效率,将提取次数固定为 2,依据单因素试验结果,以提取率为考察指标,进行正交试验,确定最优提取工艺. 正交试验因素水平设计见表 1.
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响
在实验中能观察到,随着乙醇浓度的增大,提取液的澄清度越来越好. 同时,由图 1 可知,随着乙醇浓度增加, 提取率有一个持续上升的过程. 但当乙醇浓度大于 80%后,原花青素提取率有所下降. 分析原因可能是当乙醇浓度高于80%时,一些醇溶性杂质、色素和脂溶性强的成分溶出量增加, 这些成分与原花青素争夺乙醇—水分子,使原花青素的溶出率下降,从而导
2.1.2 超声时间对葡萄籽原花青素提取率的影响
由图 2 可知, 当超声时间小于 30 min 时,随着时间的延长, 葡萄籽原花青素提取率逐渐增加；当提取时间超过 30 min 后,提取率开始下降. 分析原因可能是由于长时间的超声处理会导致原花青素的结构遭到破坏所致. 考虑到超声处理 30 min 相对处理 20 min 时提取率只有略微增加,为提高工作效率,最优超声时间以 20 min 为宜.
2.1.3 料液比对葡萄籽原花青素提取率的影响
由图 3 可知,随着溶剂用量的增加,葡萄籽原花青素提取率逐渐增加, 当料液比超过 1：20后,提取率已经趋于稳定. 说明当料液比为 1∶20时,原花青素已能充分溶出,再增加提取溶剂,提取率也不会有明显的增长,因此,料液比选择1∶20 为宜.
2.1.4 提取次数对葡萄籽原花青素提取率的影响
由图 4 可知,经过 2 次提取,大部分原花青素已充分溶出,为提取工作效率,在正交试验中不再对提取次数进行考察.
2.2 葡萄籽原花青素提取率正交实验结果
由表 2 和表 3 分析可知,影响葡萄籽原花青素提取率的因素主次顺序为 A>B>C, 即乙醇浓度对原花青素提取率的影响最大,其次是提取时间,最后为料液比. 由正交分析可得最佳工艺条件为：A2B2C3, 即乙醇浓度为 80%, 提取时间为20 min,料液比为 1∶25.
2.3 葡萄籽中原花青素提取率验证试验结果
精密称取葡萄籽粉末 5 份, 每份 1 g,按正交试验所得最佳工艺条件 , 即乙醇浓度80%,提取时间 20 min,料液比 1：25,重复提取 2 次,依照 1.2.2 的方法测定含量,计算原花青素提取率. 由表 4 可以得知,在最优条件下 , 葡 萄 籽 中 原 花 青 素 提 取 率 平 均 值 为4.45%,相对标准偏差（RSD）为 1.25%,表明该优选工艺稳定可行.
3 结论与讨论
原花青素的提取方法有热回流提取法、微波辅助法、超声波辅助法、超声—微波协同提取技术、超临界流体提取法、酶提取法等[10-13]. 传统的热回流提取法以及有机溶剂浸提法存在时间长、溶剂使用成本高,且能耗大、提取率低等问题.超声辅助提取法和微波辅助提取法等是近年来发展起来的新型提取技术,具有选择性高、耗时少、能耗低、溶剂耗量少、排污量少等优点,是目前天然产物提取的创新技术.
本文以葡萄籽原花青素提取率为指标,在单因素试验的基础上,采用正交试验对超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素的工艺条件进行了研究. 得到最优提取工艺为以 80%的乙醇为溶剂,在料液比 1：25 条件下,超声提取时间 20 min,在此条件下重复提取 2 次,葡萄籽原花青素平均提取率为 4.45%. 经 5 次验证实验表明,该工艺条件操作稳定、可行,有很好的重复性.据苏芳等[14]研究发现超声功率对提取结果影响不大,故本研究未考察该因素的影响情况,为了给葡萄籽原花青素的提取工艺研究提供更详实的数据支持,在后续的工作中有必要对其进行更系统的研究.
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（责任编辑：李堆淑）
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