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亚硝酸盐氮急性胁迫对斑尾复鰕虎鱼组织结构的影响
摘 要：为了解NO2-N急性胁迫对斑尾复缎虎鱼组织结构的影响,在水温16.5℃,盐度30‰,pH 8.0的环境下,在实验水体中加入亚硝酸钠,设置NO2-N浓度分别为1、10和100 mgjL的3个实验组及一个空白对照组,连续观察实验鱼的游动情况、呼吸频率、黏液分泌等表征,并在其死亡后立即解剖,制组织切片进行显微镜观察.结果表明,斑尾复缎虎鱼对NO2-N异常敏感,最小浓度组1 mgjL的平均死亡时间仅为8.5 h；NO2-N对斑尾复缎虎鱼的各组织器官均有一定影响,其中对鳃组织的损伤最为明显,会造成鳃丝充血,鳃小片上皮细胞增生,部分鳃小片极度膨大等病理变化,严重阻碍鱼的呼吸机能.关键词：斑尾复缎虎鱼（Synechogobius hasta）；NO2-N;急性胁迫；组织结构
斑尾复鰕虎鱼（Synechogobius hasra）与矛尾复鰕虎鱼同物异名,隶属鲈形总目( Perciformes),鰕虎鱼亚目(Gobioidei),鰕虎鱼科(Gobiidae),鰕虎鱼亚科(Gobiinae),复鰕虎鱼属(Synechogobius),在我国黄渤海、东海、台湾海峡及周边半咸水水域均有分布,属底栖鱼类,多栖息于沙泥底.该鱼生命周期仅一冬龄,亲鱼早春4月产卵后大部分死亡,捕获的野生个体大小不等,通常在50～200 g／尾,经济价值不高,属沿海小型杂鱼.由于该鱼具有摄食虾苗的习性,因此在沿海对虾养殖中往往作为敌害生物对待,通过虾池进水时的密网（80目筛绢）过滤或进水后使用茶粕予以清除.
国家虾产业体系近几年的研究结果表明,利用生物防控技术对某些病毒性虾病的防控能够取得较好效果,即通过在虾池中混养鱼类,利用鱼类摄食病死虾以减少虾病的传播.以往所公布的混养鱼类均为规模化人工养殖品种,人们对这些品种的研究相对较多,对不同品种的生态环境适应性了解较多,能够较好地处理混养中的各种问题.在国家虾产业体系以往所列的混养鱼类中并无斑尾复鰕虎鱼,但2017年河北省对虾养殖生产实践表明,该鱼的混养效果在各种混养鱼类中表现最好,尤其是在中国对虾的养殖中.在每hm2放养600尾左右的斑尾复鰕虎鱼时能够取得较理想的效果,即摄食病死虾的比例超过70%（摄食健康虾的比例低于30%）,同时基本控制了病毒性虾病（尤其是白斑综合征）的流行,斑尾复鰕虎鱼未来有望成为重要的对虾养殖生物防控混养鱼类.目前该鱼尚未有人工规模化养殖,市场上的商品多来自海捕和虾池捕捞,人们对其生态环境要求和各种环境胁迫缺乏了解,在养殖中的环境调控往往缺乏依据,亟需进行相关研究.NO2-N是水产养殖中的重要水质指标,在对虾养殖的中后期往往偏高,而NO2-N对斑尾复鰕虎鱼的影响尚不得而知.本实验通过研究NO2-N急性胁迫后该鱼的组织结构变化,以阐明NO2-N对斑尾复鰕虎鱼的影响,丰富该鱼环境胁迫反应数据库,为养殖实践提供数据支持.
1材料与方法
1 1 实验材料
实验用斑尾复鰕虎鱼捕捞自河北省黄骅市沿海,平均全长36.8 cm,平均体重184.3 g；实验水槽为体积30 L水族箱；实验用水为海水晶十曝气ld的自来水配制的人工海水；添加的NO2-N使用亚硝酸钠分析纯.制作切片的各种试剂为常规试剂.
1 2 实验方法
斑尾复鰕虎鱼在实验开始前暂养2 d,选用规格相近、体色正常、体表无外伤、健壮的个体用于胁迫实验；实验用水水温16.5℃,盐度30‰,pH8．O；在水族箱中加入20 L人工海水,每个箱中放入2条实验鱼,不充气,静水实验；以NO2-N为计算单位加入亚硝酸钠,浓度设置为1、10和100mg/L,每组设3个平行,设一个对照组.实验期间不投喂.
实验开始后观察不同浓度组实验鱼的游动情况、呼吸频率、黏液分泌等表征；实验鱼一旦出现死亡,立即解剖,取鳃、肝脏、肾脏和脾脏,Bouin氏液固定,经自来水冲洗、梯度酒精脱水、透明、透蜡和石蜡包埋等步骤后进行切片,切片厚度5μm；采用苏木精 伊红染色法(H．E)染色,BK5000显微镜观察并拍照.
2结果与分析
2 1 实验结果
2.1.1 实验鱼表征 实验鱼加入配制好亚硝酸钠的水中后,除有短暂应激反应外,基本没有异常表现,比较安静,仅胸鳍微微摆动,与对照组相同.100 mg/L浓度组实验鱼17 min后开始急速游动,30 min后逐渐趋于平静（麻痹）；10 mg/L浓度组在实验进行到4h时出现了7 min左右的剧烈游动,其后反应平静；1 mg/L浓度组实验鱼始终处于平静状态.100 mg/L浓度组实验鱼在实验开始2h后体色变浅、发白,体表分泌过多黏液；10 mg/L浓度组实验鱼4.5 h后体色开始发白,黏液增多；1 mg/L浓度组实验鱼6h后体色开始发白,黏液增多.实验开始0.5 h时,对照组鱼鳃盖张合次数为平均26次／min,1 mg/L浓度组为平均30次／min,10 mg/L浓度组为平均34次／min,100 mg/L浓度组为平均57次／min；实验进行2h时,对照组鱼鳃盖张合次数为平均27次／min,1 mg/L浓度组为平均34次／min,10mg/L组为平均41次／min,100 mg/L组为平均22次／min；实验进行3h时,100 mg/L浓度组开始有死亡出现,该浓度组鱼鳃盖张合次数平均仅为8次／min,对照组鱼鳃盖张合次数为27次／min,1 mg/L浓度组为35次／min,10 mg/L浓度组为平均40次／min.
100 mg/L浓度组实验鱼在实验进行3h开始陆续死亡,平均死亡时间为3.5 h；10 mg/L浓度组实验鱼在实验进行6.2 h开始陆续死亡,平均死亡时间为7．O h;l mg/L浓度组实验鱼在实验进行7.5 h开始陆续死亡,平均死亡时间为8.5h.对照组鱼没有出现死亡.
2.1.2N02-N对斑尾复鰕虎鱼组织结构的影响 不同浓度NO2-N急性胁迫对斑尾复鰕虎鱼鳃、肝脏、肾脏和脾脏的组织结构影响见图版I 图版IV(见封二、封三).
2 2分析
斑尾复鰕虎鱼在NO2-N胁迫下的主要反应包括游动状况的改变、体色变化（黏液增多）和呼吸频率的改变.其中最高浓度组(100 mg/L)实验鱼最早出现剧烈游动,显示出鱼的极度不适性；中等浓度组(10 mg/L)在实验进行到4h时出现这种情况,出现的时间点基本是死亡的半数时间（平均死亡时间8.5 h）；但最小浓度组实验鱼在实验过程中没有出现异常游动.实验鱼的体色变浅、发白与黏液分泌过多有关,药物浓度越高,黏液分泌就越多；不同浓度组鱼体色变化的时间均出现在约2/3死亡时间时,如10 mg/L浓度组实验鱼在4.5 h开始出现体色变化,而其平均死亡时间为7．O h.100 mg/L浓度组的实验鱼在实验进行0.5 h时,鳃盖张合次数达到57次／min(对照组则为27次／min),说明高浓度的NO2-N对斑尾复鰕虎鱼的刺激较强,而当实验进行2h时,鳃盖张合次数降为22次／min,而实验进行3h（到了接近死亡时）,鳃盖张合次数降到了仅为8次／min；另外2个浓度组也有类似表现,只不过发生的时间有所区别.这种表现符合毒物对生物的胁迫规律,即先兴奋,后逐渐麻痹.
本次实验中斑尾复鰕虎鱼在NO2-N胁迫下死亡较快,100 mg/L浓度组仅为3.5 h,1 mg/L浓度组也仅仅8.5 h.分析其原因可能有2点：1、实验鱼暂养时间较短,还没有完全适应小水体十人工海水的实验环境,其自身处于应激状态,对药物的抗性较差；2、斑尾复鰕虎鱼对NO2-N非常敏感.为进一步进行验证,我们又进行了一次低浓度胁迫实验,将NO2-N浓度梯度设置为0.2 mg/L、0.4 mg/L和0.8 mg/L,其它实验条件相同.实验结果显示,0.2 mg/L浓度组的平均死亡时间为26.2 h,0.4 mg/L浓度组为24.5 h,0.8 mg/L浓度组为17.5 h.低浓度胁迫实验结果说明斑尾复鰕虎鱼的确对NO2-N异常敏感.
亚硝酸盐对水产动物的主要危害表现为将其体内血红蛋白球中的血红蛋白转化为高铁血红蛋白,同时影响其抗氧化酶活性和溶菌酶的活力,从而导致组织缺氧、膜通透性改变、组织自溶性提高及组织坏死等病理现象[4-5].组织切片结果显示,NO2-N对斑尾复鰕虎鱼鳃、肝脏、肾脏和脾脏等组织器官均有一定程度的影响.其中,对脾脏的影响最小,主要出现脾脏轻度萎缩、充血、炎性细胞浸润等变化,这些变化在鱼的一般性应激中也经常存在,不能确定是NO2-N所造成的.NO2-N对斑尾复鰕虎鱼肾脏的影响次之,主要表现为肾小管颗粒变性,肾间质萎缩,炎性细胞浸润等变化,其中,在最高浓度组(100 mg/L)出现了部分肾间质坏死的变化.NO2-N对斑尾复鰕虎鱼肝脏的影响相对较大,低浓度组出现了轻度水泡变性,肝细胞界限略模糊等变化,中等浓度组(10 mg/L)则出现了明显的淤血现象,而最高浓度组则出现肝细胞肿胀,细胞界限模糊,嗜碱性物质增加,肝细胞深染等变化,同时胰脏明显充血.NO2-N对斑尾复鰕虎鱼鳃的影响最大,无论是低浓度组还是高浓度组均出现了明显变化,其中,低浓度组表现为鳃小片上皮细胞轻度增生,鳃小片轻度充血,中等浓度组表现为鳃小片上皮严重增生,高浓度组由于鳃小片上皮的增生,部分鳃小片出现了融合（棍棒化）现象,此外,部分鳃小片膨大呈球状(图版I,图5/6),内部充满血细胞.病理切片表明,斑尾复鰕虎鱼的死亡原因主要是鳃组织出现严重病变,造成呼吸障碍而导致的.
N02 N对各种对虾的急性毒性影响曾有过一些报道,如王娟等使用体长为1. 9～2.1 cm的中国对虾,在水温21℃,盐度30‰～31‰,pH7. 99,溶氧5.2～6．O mg/L的条件下进行了NO2-N的急性毒性实验,结果表明96 h的安全浓度为4. 38 mg/L[6]；周光正报道了台湾学者J． C．Chen在水温26℃,盐度33‰,pH 7.94的条件下使用NO2-N对中国对虾稚虾(3.96&plun;0. 18 cm,0.36&plun;0.06 g)的急性毒性实验,结果表明96 h的安全浓度为2.30 mg/L[7]；姚庆祯等在水温29℃,比重1. 021,pH 8.36的条件下进行了NO2-N对凡纳对虾和日本对虾幼体的急性毒性实验,结果表明,NO2-N对凡纳对虾、日本对虾Zl、M1、P6的安全浓度(96 h)分别为0.56、0. 77、2.57 mg/L与1.08、0.45、2.06 mg/L；彭自然等在水温28.3&plun;2.6℃,比重1.006 5,pH8. 23的条件下进行了NO2-N对平均体长、体重分别为9. 92&plun;1.03 mm/尾、10. 66 mg/尾的凡纳滨对虾幼虾的急性毒性实验,结果表明,96 h的安全浓度为1.9 mg/L.上述研究显示我国养殖的主要对虾品种对NO2-N均有一定的耐受能力,96h的安全浓度一般在2 mg/L以上,且对虾的个体越大,其耐受能力就越高.对照本实验结果,斑尾复鰕虎鱼对NO2-N的耐受能力要明显低于对虾.在生产实践中如果忽视这种现象,可能出现的情况是养殖户过于关注对虾的生长状况而往往忽视用于清除病死虾的斑尾复鰕虎鱼,从而导致生物防控病害失效.
鉴于斑尾复鰕虎鱼经济价值较低和以往作为敌害鱼类的认识,人们对该鱼的研究相对较少,有关生长及繁殖的报道仅有几篇,如罗刚等进行了矛尾复鰕虎鱼性腺发育及个体繁殖力研究口0],还进行了矛尾复鰕虎鱼越冬暂养技术的研究,李莉等进行了矛尾复鰕虎鱼室内人工繁育实验研究[12].有关环境（药物）胁迫的报道也较少,仅有刘香江等研究了铜、镉和乙酞甲胺磷对矛尾复鰕虎鱼的急性毒性影响口.],黄超等研究了水体铜和锌暴露对矛尾复鰕虎鱼肝脏脂代谢的影响[14],税春等研究了盐度渐变对斑尾复鰕虎鱼幼鱼血清渗透压和离子浓度及鳃丝Na+／K+-ATP酶活力的影响口5].在GB 3097 1997（海水水质标准）中,无机N的最高限值为0.5 mg/L,而实际生产中,在养殖中后期,随着养殖密度的增大、投饵量的增多、残饵粪便的沉积,NO2-N的浓度也往往超标,远高于GB 3097 1997中规定的数值,NO2-N对生物防控中混养鱼类的影响不容忽视.本项研究首次阐明了N02-N对斑尾复鰕虎鱼的组织结构影响,为进一步探讨环境胁迫对斑尾复鰕虎鱼的影响机理奠定了一定基础.研究结果可用于养殖实践,为鱼、虾混养时环境的调控提供一定的理论依据.
组织结构论文范文结:
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